将实验室前期构建测序正确的含RGD修饰的乙肝核心病毒重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,单因素分析及正交试验探究重组蛋白最适表达条件。在最适表达条件下扩培,收集菌体超声破碎后离心,采用凝胶过滤层析、离子交换和蔗糖密度梯度离心进行纯化,利用透射电镜对形成的RGD-HBc VLPs的形态及稳定性进行鉴定。纯化的RGD-HBc VLPs利用其体外自组装的特性,将光敏剂ICG装载到颗粒的内部,通过静脉注射到4T1乳腺癌荷瘤小鼠,探究重组RGD-HBc VLPs作为纳米递送系统的靶向性。RGD-HBc VLPs在温度32℃、IPTG 0.5mmol/L、诱导4h时以可溶性蛋白的形式得到高效表达。经蔗糖密度梯度离心纯化后纯度到达95%以上。透射电镜下观察纯化的RGD-HBc VLPs形态、大小均一,直径约为32nm,通过近红外荧光成像证实了RGD-HBc作为纳米载体的靶向性。经表达和纯化后,RGD-HBc VLPs具有较高的表达量和大小均一的形态外貌,近红外荧光成像证实具有较好的靶向性,这不仅为肿瘤的可视化诊断提供一种快速、精准、方便的方法,而且为今后靶向免疫治疗提供一种新型载体。
目前, 随着纳米技术的发展, 纳米粒子的靶向递送系统取得极大的进步, 已被广泛的应用于癌症的治疗与成像[1]。与全身给药相比,纳米递送系统具有以下优势:(1)药物可以通过纳米粒子的靶向性被运送到特定的部位,减少药物对正常器官的毒副作用;(2)可以提高药物在靶部位的浓度;(3)药物可被运送到不易到达的部位。目前,已被广泛应用的纳米载体有脂质体、聚合物、胶束和病毒样颗粒。病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)是多个蛋白质亚基组装而成的纳米颗粒,由于其不含核酸、不能自主复制、形态与真正病毒粒子相似,又称“伪病毒或假病毒”[2,3]。病毒样颗粒的生物相容性好、安全无毒,具有中空内部空间,内外表面具有多个可用于化学交联的位点可以用来包装siRNA、核酸类、多肽等小分子药物等,在疫苗、基因或药物载体的研究开发中充当重要角色[4,5,6],是近年来生物制药工程领域的热点之一。
RGD序列是由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的短肽序列.它可以与大多数整合素蛋白发生特异性结合,从而使含有RGD 序列的化合物可以靶向于整合素蛋白过表达的肿瘤细胞或肿瘤内皮血管。本研究以RGD修饰的乙肝核心病毒样颗粒为研究对象[7],优化具有肿瘤靶向RGD-HBc病毒样颗粒的表达条件及进行纯化[8,9],以获得高纯度的RGD-HBc VLPs。通过荷瘤鼠荧光成像,证实RGD-HBc VLPs的靶向能力[10,11],以期能为临床肿瘤诊疗提供一种新型的靶向纳米递送材料。
1.2.1 生长曲线测定将重组质粒转化入BL21(DE3)感受态大肠杆菌中,接菌环取一环重组菌株接种于LB 平板上,37℃过夜培养。挑取单菌落接种到LB 液体培养基中,37℃、200r/min 培养过夜。按体积比1:100 接入LB 培养基中扩大培养,此时开始计时,分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6h 各取1ml 菌液测定OD600nm 值,以时间为横坐标、OD600nm值为纵坐标,绘制菌株的生长曲线,以研究其生长规律,确定最佳诱导时机。
挑取单菌落转接至LB培养基(含氨苄青霉素50mg/ml)中,置振荡培养箱中37℃培养12~14h,得到活化种子菌。
1.2.3 正交设计优化诱导表达条件根据单因素分析结果,设计3×3正交试验,以不同诱导时间(2、4 、8h)、不同诱导温度(20、26、32℃)和不同诱导剂IPTG 浓度(0.20、0.5、1.0mmol/L)3因素3水平(表1)进行表达优化,研究RGD-HBc重组菌水平表达的规律。
1.2.4 重组蛋白表达形式分析按照优化出的表达条件诱导表达的菌体, 4℃、12 000r/min离心10min, 收集沉淀, 用灭菌PBS洗3次后加入适量含PMSF的PBS混匀, 在冰上进行破碎, 4℃、12 000r/min离心10min, 分别取上清液和沉淀按照上述方式进行SDS-PAGE, 确定重组蛋白的表达形式。
1.2.6 RGD-HBc重组蛋白颗粒稳定性探究为了考察重组蛋白颗粒的稳定性,将纯化后的RGD-HBc重组蛋白分别存于4℃和-20℃各30天,之后取出将适量的样品滴加在铜网上,加入5%的醋酸铀负染5min,室温下干燥后,在透射电子显微镜(TEM)下观察病毒样颗粒的形貌。
1.2.7 RGD-HBc/ICG VLPs近红外荧光成像靶向性研究利用RGD-HBc VLPs自组装的特性,在尿素存在的条件下对RGD-HBc VLPs去组装,与光敏剂ICG水溶液(去离子水溶解)混匀后逐渐改变去组装环境,RGD-HBc VLPs亚基重新自组装,在自组装的过程中ICG以游离或静电作用力相结合的方式装载到RGD-HBc VLPs的内部。采用紫外可见分光光度计检测在780nm的吸光度,建立浓度-吸光度标准曲线,根据RGD-HBc/ICG VLPs在780nm的吸光度,根据ICG标准曲线计算出ICG含量。
选用雌性Babl/c小鼠建立4T1乳腺癌肿瘤模型,用于小动物近红外荧光成像。取对数生长期1×105个4T1乳腺癌细胞,以皮下注射的方式注射到右后肢腋处,将注射后的小鼠置于标准条件下培养,使用游标卡尺测量瘤体,待瘤体长至100mm3时,进行药物注射。分别将RGD-HBc/ICG VLPs、ICG、RGD-HBc VLPs(ICG:1mg/kg)进行尾静脉注射,于注射10min、4h、8h后使用 IVIS小动物光学成像系统(激发波长在780nm处,发射波长在830nm处)观察不同时间段荧光分布情况。为了确定RGD-HBc/ICG VLPs的生物分布,在8h时对注射药物的乳腺癌4T1荷瘤鼠进行解剖,观察荧光在各器官的分布情况。
生长曲线反映了工程菌的生长变化趋势,从而可以确定该重组菌株在某一时刻所处的生长阶段,依此为依据,选择合适的诱导条件进行诱导。由BL21/PET-32a-RGD-HBC重组菌株的生长曲线h 时菌株处于对数生长期。
采用Bio-Rad凝胶成像系统(Gel DocTM XR+)中Quantity one分析各样品中重组蛋白占总蛋白的百分含量。从SDS-PAGE结果图2a中发现,在其他诱导条件一致的情况下,RGD-HBc重组菌在pH为6和7时表达量较大。pH为7时蛋白质表达量最高,占菌体蛋白质表达总量的34.2%。诱导温度对蛋白质表达量的高低起到至关重要的作用。从SDS-PAGE结果图2b中发现,在其他诱导条件一致的情况下,诱导温度为20℃时,RGD-HBc重组菌蛋白表达量占菌体总蛋白量的32.5%,表达量达到最高。在其他诱导条件一致的情况下,随着诱导时间的延长,重组菌144蛋白表达量也逐步增加(图2c),在加入IPTG 8h时,RGD-HBc重组菌蛋白表达量占菌体总蛋白量的49.5%,表达量达到最高。随着诱导时间的继续延长,目的蛋白表达量稍有降低,而外源蛋白的表达量增多,可能是外源蛋白的表达影响了菌体的正常生长。pET原核表达体系受到IPTG诱导,启动lacUV5过量表达T7RNA 聚合酶,从而产生大量的目的蛋白。如图2d所示,在其他诱导条件一致的条件下,当IPTG浓度达到 0.50mmol/L时,RGD-HBc重组菌蛋白表达量最高,占菌体总蛋白量的70%。
正交试验设计是研究多因素多水平的又一种设计方法,它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验,这些有代表性的点具备了“均匀分散,齐整可比”的特点。正交试验设计是分析因式设计的主要方法,是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。为了获得较为优良的诱导表达条件,我们采用正交试验进行优化。正交试验SDS-PAGE图如图3所示。对9组条件下的电泳图用Gel DOC 凝胶成像系统分析各样品中重组蛋白占总蛋白的百分含量,分析结果如表2所示。从极差分析可知,RGD-HBc重组菌表达量影响因素大小依次为温度诱导时间IPTG浓度。这表明温度对于原核表达系统成功转录和翻译外源基因的表达起着至关重要的作用。实验条件下优化的最佳组合为温度32℃、IPTG 0.5mmol/L、诱导4h。此诱导条件下RGD-HBc重组菌目的基因表达量为49.3%。
扩大培养后收集菌液,离心后超声破碎,收集上清和沉淀,分别进行SDS-PAGE,如图4所示。从电泳结果可以看出,目的蛋白主要存在于超声破碎菌液的上清中,说明RGD-HBc重组蛋白以可溶性蛋白存在。
获得产量和纯度较高的蛋白质是进行后续实验的基础。将RGD-HBc重组菌进行扩大培养表达后收集超声后的上清,对上清进行硫酸铵沉淀,重悬过滤后经凝胶层析,阴离子纯化及蔗糖密度梯度离心后的电泳图如图5如示。从电泳图中可以看出,随着纯化的进行,电泳图中的杂带越来越少,说明每一步纯化都能起到去除杂蛋白的作用,经过最后的超速离心纯化后,可以看到约在24kDa处有一条清晰的目的条带,经采用Bio-Rad凝胶成像系统(Gel DocTM XR+)中Quantity one分析,RGD-HBc重组蛋白的纯度达到92%以上。
将超速离心纯化后的蛋白质,分别4℃和-20℃保存30天,通过透射电子显微镜观察蛋白质颗粒形态和大小,电镜图如图6所示。4℃和-20℃情况下,RGD-HBc VLPs的形态、大小仍然均一,保存30天颗粒在形态方面仍无大的变化,说明重组蛋白颗粒稳定性较好。
如图7a所示,从包装后RGD-HBc /ICG VLPs的透射电镜结果来看,包装前后并没有造成颗粒的直径发生大的变化,说明ICG的加入并不影响颗粒的自组装,经DLS粒径检测仪检测粒径约为32nm(图7b。
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